اصطلاحات و تعاریف در آزمایشگاه میکروبیولوژی
کلیفرم ها
گروهی از باکتری های هوازی و بی هوازی اختیاری ، گرم منفی ، میله ای شکل و بدون اسپور هستند که قادرند در شرایط هوازی در محیط های کشت انتخابی لاکتوزدار در دمای 5/0 ± 35 درجه سلسیوس در مدت 24 تا 48 ساعت تولید اسید و گاز کنند .
اساس روش
این روش براساس تلقیح حجم معینی از نمونه آب به محیط انتخابی لاکتوز دار و گرمخانه گذاری در دمای 5/0 ± 35 درجه سلسیوس انجام می پذیرد . سپس با استفاده از محیط های کشت انتخابی و تائیدی ، وجود کلیفرم ها تائید می شود .
نمونه برداری
دست کم 500 میلی لیتر آب را ( طبق استاندارد ملی 4208 ) سال 1376 آئین کار نمونه برداری از آب جهت آزمونهای باکتریولوژی نمونه برداری کنید .
مواد لازم
محیط های کشت
آبگوشت P-A 1
ترکیبات مقدار (غلضت معمولی ) مقدار (غلضت سه برابر )
عصاره گوشت گوساله 3 گرم 9 گرم
پپتون 5 گرم 15 گرم
لاکتوز 46/7 گرم 38/22 گرم
تریپتوز 8/9 گرم 49/ 29 گرم
دی پتاسیم هیدروژن فسفات 35/1 گرم 05/4 گرم
منوپتاسیم هیدرژن فسفات 35/1 گرم 05/4 گرم
کلرید سدیم 46/2 گرم 38/7 گرم
لوریل سولفات سدیم 05/0 گرم 15/0 گرم
بروموکروزول ارغوانی 0085/0 گرم 0255/0 گرم
آب مقطر 1000 میلی لیتر 1000 میلی لیتر
طرز تهیه :
ترکیبات فوق را با جوشاندن در آب مقطر حل نمائید . سپس به حجم های 50 میلی لیتر در ظروف شیشه ای با گنجایش 250 میلی لیتری ریخته ، و در اتوکلاو با دمای 1 ± 121 درجه سلسیوس به مدت 12 دقیقه سترون کنید . pH نهایی محیط باید 2/0± 8/6 باشد.
3
7-1-2 آبگوشت لاکتور – صفرا – سبز درخشان 1 ( BGLB)
ترکیبات مقدار
پپتون 10 گرم
لاکتوز 10 گرم
پودر صفرای گاوی 20 گرم
سبز درخشان 13 میلی لیتر
آب مقطر 1000 میلی لیتر
طرز تهیه :
پپتون را در 500 میلی لیتر آب مقطر حل کنید . سپس 20 گرم صفرای گاوی را که در 200 میلی لیتر آب مقطر جداگانه حل نموده اید ، به آن اضافه کنید . pH این محلول باید برابر 5/0± 7 باشد.حجم محلول فوق را با آب مقطر به 975 میلی لیتر رسانده و پس از افزودن لاکتوز به آن ، pH را برابر 4/7 تنظیم کنید . محلول سبز درخشان را به آن افزوده و با آب مقطر به حجم 1000 میلی لیتر برسانید . سپس در لوله های حاوی دورهام به حجم های 5 میلی لیتری ریخته و در اتوکلاو با دمای 115 درجه سلسیوس به مدت 10 دقیقه سترون کنید .
یادآوری : چنانچه محیط های کشت به صورت تجارتی دردسترس باشد ، طبق دستورالعمل سازنده انجام دهید .
آبگوشت لوریل تریپتوز1 ( باغلظت مضاعف )
تریپتوز 40 گرم
لاکتوز 10 گرم
کلرید سدیم 10 گرم
دی پتاسیم هیدروژن فسفات 5/5 گرم
پتاسیم دی هیدروژن فسفات 5/5 گرم
لوریل سولفات سدیم 2/0 گرم
آب مقطر 1000 میلی لیتر
طرز تهیه :
تریپتوز ، لاکتور ، کلرید سدیم و دی پتاسیم هیدروژن فسفات را به آب مقطر اضافه کرده و حرارت دهید تا حل شوند . سپس لوریل سولفات سدیم را به آن افزوده و به آرامی تکان دهید به گونه ای که کف نکند . pH را برابر 2/0 ± 8/6 تنظیم نمائید و در حجم های 10 و 50 میلی لیتری در لوله های حاوی دورهام تقسیم نموده و در اتوکلاو با دمای 3 ± 115 درجه سلسیوس به مدت 10 دقیقه سترون کنید.
وسایل لازم
از وسایل معمول در آزمایشگاه میکروب شناسی (طبق استاندارد ملی 2747 ) سال 1380 آئین کار در آزمایشگاه میکروب شناسی استفاده کنید .
روش اجرای آزمون
تلقیح نمونه
نمونه مورد آزمــون را به مــدت 5 ثانــیه بشدت تکان دهید. سپس 100 میلی لیتر از آن را به 50 میلی لیتر محیط کشت آبگوشت P-A بند 7-1-1 با غلظت سه برابر تلقیح نموده و پس از یکنواخت شدن ، در دمای 5/0 ± 35 درجه سلسیوس به مدت 24 تا 48 ساعت گرمخانه گذاری نمائید .
بررسی نمونه
نمونه تلقیح شده بند 9-1 را پس از پایان زمان گرمخانه گذاری بررسی کنید . مشاهده رنگ زرد در محیط کشت آبگوشت P-A نشانگر تخمیر لاکتوز و تولید اسید و گاز همچنین حباب گاز
است. که با تکان دادن ظرف به آرامی حباب گاز و کف را می توانید در سطح آن مشاهده کنید. تولید اسید و گاز نشانگر وجود احتمالی کلیفرم ها در نمونه مورد آزمون می باشد که برای تائید آن باید آزمون تائیدی انجام پذیرد .
9-3 آزمون تائیدی
برای تائید وجود کلیفرم ها ، با استفاده از حلقه کشت سترون ، از کشت بند 9-2 که تولید اسید و گاز نموده اند ، برداشت نموده و به محیط کشت آبگوشت لاکتوز - صفرا - سبز درخشان بند
-انتــقال داده و در دمای 5/0± 35 درجه سلسیوس به مدت 24 تا 48 ساعت گرمخانه گذاری نمائید. مشاهده گاز و کف در محیط فوق ، نشانگر وجود باکتری های کلیفرم در نمونه مورد آزمون می باشد .
بیان نتایج
نتایج را بصورت "" کلیفرم ها در 100 میلی لیتر نمونه آب وجود دارد "" و یا "" کلیفرم ها در 100 میلی لیتر نمونه آب وجود ندارد "" بیان کنید .
گزارش آزمون
گزارش آزمون باید دارای آگاهی های زیر باشد :
1 مشخصات کامل نمونه مانند ( نوع نمونه ، تاریخ و محل نمونه برداری ، تاریخ ارسال نمونه به آزمایشگاه )
۲ -روش آزمون طبق استاندارد ملی .................... .
-3 بیان نتایج طبق بند 10 این استاندارد
-4 سایر اطلاعات که مرتبط با روش آزمون